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陕西新研博美生物科技有限公司

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新型钙离子荧光探针 点亮你的科研之路
发布时间:2019-01-01        浏览次数:1117        返回列表

新型钙离子荧光探针 点亮你的科研之路

简介 :
    Calbryte™520
Calbryte™590 Calbryte™630 提供最强大的均匀荧光测定工 具,用于检测细胞内钙动员。与现有的钙指示剂(如 Fluo-3 AMFluo-4 AM Rhod-2 AM)相比,这些钙敏感染料明显更亮,并提供更高的信噪比,大大提高了 细胞内保留和负载效率。表达通过钙发出信号的 GPCR 或钙通道的细胞可以预装载 穿过细胞膜的 Calbryte TM 520 AMCalbryte TM 590 AM Calbryte TM 630 AM。 一旦进入细胞内,Cal520®AMCalbryte™590 AM Calbryte™630 AM 的亲脂性阻 断 AM 基团被细胞内酯酶切割,产生带负电荷的荧光 Calbryte™染料,留在细胞内。 它们与钙结合后的荧光大大增强。当用激动剂刺激细胞时,该受体表达细胞内钙的 释放,这显着增加了 Calbryte™520Calbryte™590 Calbryte™630 的荧光。高灵 敏度和> 100 倍荧光增强的特性使 Calbryte ™ 520 AM Calbryte ™ 590 AM Calbryte™630 AM 是测量细胞内钙的最强大指标。

    除了方便的激发波长和钙的大荧光增强外,Calbryte™520Calbryte™590 Calbryte™630 主要定位于细胞溶胶中,不像 Rhod-2 主要位于线粒体中。 此外, Calbryte™590 Calbryte™630 Ex / Em 波长使这些染料成为完美的钙指示剂, 可与绿色荧光蛋白(GFP)细胞系进行多色检测。 此外,Calbryte™520Calbryte ™ 590 Calbryte ™ 630 钙测定经过优化,可与大多数现有荧光仪器兼容。 Calbryte™520 可在 488 nm 处激发,并与 FITC 滤光片组配合使用。 Calbryte™590 经过优化,可在 555 nm 激发,并与 TRITC / Cy3 滤光片组配合使用。 Calbryte™ 630 经过优化,可在 594 nm 激发,并与 TexasRed®滤光片组配合使用。 光谱和钙 结合特性总结如下。

Calbryte™520Calbryte™590 Calbryte™630 试剂的光谱和 Ca 2+结合特性

Ca 2+ Indicator   Excitation(nm)   Emission(nm)   Kd(uM)

Calbryte™520         492nm             514nm           1.2

Calbryte™590         580nm             592nm           1.4

Calbryte™630         608nm             624nm           1.2

使用 Calbryte™520 AM ,Calbryte™590 AM Calbryte™630 AM 酯类
1.使用 Calbryte™520,Calbryte™590 或 Calbryte™630 AM 酯类称重传 感器:

    Calbryte™AM 酯应在使用前在无水 DMSO 中重新配制。 DMSO 储备溶液可以在- 20℃下储存(干燥)并避光。 在这些条件下,AM 酯应稳定三个月。

以下是我们推荐的将 Calbryte™520 AM,Calbryte™590 AM 或 Calbryte™630 AM 酯加入活细胞的方案。 该说明仅提供指南,应根据您的特定需求进行修改。

a) 在 无 水 DMSO 中 制 备 2 至 5mM Calbryte TM 520AM , Calbryte TM 590AM 或 Calbryte TM 630AM 酯的储备溶液。

b)将 Calbryte TM 520 AM,Calbryte TM 590 AM 或 Calbryte TM 630 AM 溶解在 DMSO 中或将等份的指示剂储备溶液解冻至室温。 在 Hanks 和 Hepes 缓冲液(HHBS) 或您选择的缓冲液(0.04%Pluronic®F-127)中制备 10 至 20μM 的染料工作溶液。 细胞加载所需指示剂的确切浓度必须根据经验确定。 注 意 : 非 离 子 型 洗 涤 剂 Pluronic®F-127 有 时 用 于 增 加 Calbryte ™ 520 AM , Calbryte™590 AM 或 Calbryte™630 AM 酯的水溶性。 各种 Pluronic®F-127 解决方 案可从 AAT Bioquest 获取。

c)如果您的细胞(如 CHO 细胞)含有有机阴离子转运蛋白,可将丙磺舒(1-2 mM) 添加到染料工作溶液中(最终浓度为 0.5-1 mM) 注意:各种 ReadiUse™丙磺舒(包括水溶性钠盐和稳定溶液)均可从 AAT Bioquest 获取。

d)将等体积的染料工作溶液(来自步骤 b 或 c)加入细胞板中。

e)将染料加载板在细胞培养箱中孵育约 60 分钟,然后将板在室温下再孵育 15 分 钟。

f)用 HHBS 或您选择的含有阴离子转运蛋白抑制剂(如 1 mM 丙磺舒)的缓冲液替 换染料工作溶液,以去除多余的染料。

g)对于 Calbryte TM 520 AM,在 Ex / Em = 490 / 525nm 处进行钙测试,对于 Calbryte TM 590 AM,使用 540/590nm 进行钙测试,对于 Calbryte TM 630 AM,使 用 610/640nm 进行钙测试。

2.测量细胞内钙响应:

图 1. CHO-K1 细胞中内源性 P2Y 受体 对 ATP 的反应。 将 CHO-K1 细胞以每 孔 100μL 每孔 40,000 个细胞接种过 夜,在 96 孔黑色壁/透明底板中。 将含 有丙 磺舒的 HHBS 中的 100μ LFluo- 4AM 或 Calbryte TM 520AM 加 入 孔 中,并将细胞在 37℃下孵育 45 分钟。 用 200 μ LHHBS 替 换 染 料 加 载 培 养 基,加入 50μL50μMATP,并使用 FITC 通道用荧光显微镜(Keyence)成 像。


图 2.用 Calbryte TM 520 或 Fluo-4 AM 测 量的 CHO-M1 细胞中外源 M1 受体的 卡巴胆碱刺激的钙响应。 在 96 孔黑壁 /透明底板中,将 CHO-M1 细胞以每 100μL/孔 40,000 个细胞接种过夜。 将 100 μ LFluo-4AM 或 不 含 丙 磺 舒 的 Calbryte TM 520AM 加入细胞中,并将细 胞 在 37 ℃ 下 孵 育 45 分 钟 。 通 过 FlexStation 3 ( Molecular Devices ) 添 加 Carbachol(50μL/孔)以达到最终 指示的浓度。
 
图 3. CHO-K 细胞中内源性 P2Y 受体对 ATP 的反应。 在 96 孔黑壁/透明底板 中 , 将 CHO-K 细 胞 以 每 100 μ L/ 孔 40,000 个细胞接种过夜。 将 100μL 具有 2mM 丙 磺 舒 的 HbBS 中 的 Calbryte TM 590AM 或 Calbryte TM 630AM 加 入 孔 中,并将细胞在 37℃下孵育 1 小时。 将 染料加载培养基替换为 200μLHHBS, 用 50 μ L50 μ MATP 处 理 , 并 使 用 TRITC 通道(Calbryte TM 590)和 Texas Red Channel(Calbryte TM 630)用荧光显 微镜(Keyence)成像。

使用 Calbryte™520,Calbryte™590 或 Calbryte™630 盐

钙校准可以通过测量具有精确已知的游离 Ca 2+浓度的溶液中的指示剂的盐形式 (荧光微板读数器中 25 至 50μM)的荧光强度来进行。 可以使用基于 30mM MOPS EGTA Ca 2+缓冲液的校准溶液。 通常,水含有微量的钙离子。 强烈建议使用 30 mM MOPS + 100 mM KCl,pH 7.2 作为缓冲系统。 我们可以简单地制作如下所列的 0 和 39μM 钙原液,这两种溶液用于制备不同 Ca 2+浓度的系列溶液。

A.0 µM calcium: 30 mM MOPS + 100 mM KCl, pH 7.2 buffer + 10 mM EGTA

B. 39 µM calcium: 30 mM MOPS + 100 mM KCl, pH 7.2 buffer + 10 mM EGTA + 10 mM CaCl2

为了确定溶液的游离钙浓度或单波长钙指示剂的 Kd,使用方程:

                                            [Ca]free = Kd[F ─ Fmin]/[Fmax ─ F]

其中 F 是特定实验钙水平下指示剂的荧光强度,Fmin 是不存在钙时的荧光强 度,Fmax 是钙饱和探针的荧光强度。

解离常数(Kd)是探针对钙的亲和力的量度。 与校准溶液相比,荧光指示剂 的钙结合和光谱性质在细胞环境中变化非常显著。细胞内指标的原位反应校准通常 产生显著高于体外测定的 Kd 值。 通过在离子载体如 A-23187,4-溴 A-23187 和离 子霉素存在下将加载的细胞暴露于受控的 Ca 2+缓冲液来进行原位校准。 或者,细 图 3. CHO-K 细胞中内源性 P2Y 受体对 ATP 的反应。 在 96 孔黑壁/透明底板 中 , 将 CHO-K 细 胞 以 每 100 μ L/ 孔 40,000 个细胞接种过夜。 将 100μL 具有 2mM 丙 磺 舒 的 HbBS 中 的 Calbryte TM 590AM 或 Calbryte TM 630AM 加 入 孔 中,并将细胞在 37℃下孵育 1 小时。 将 染料加载培养基替换为 200μLHHBS, 用 50 μ L50 μ MATP 处 理 , 并 使 用 TRITC 通道(Calbryte TM 590)和 Texas Red Channel(Calbryte TM 630)用荧光显 微镜(Keyence)成像。胞透化剂如洋地黄皂苷或 X-100 可用于将指示剂暴露于细胞外培养基的受控 Ca 2 +水 平。

结论

由于 Ca 2+在生物学中的重要性,已经建立了许多用于分析细胞和/或亚细胞 Ca 2+ 活性机制的技术/方法。 尽管用于分析 Ca 2+活性的每种方法都具有优于其他方法的 某些优点,但每种方法也存在缺点。 凭借上述出色的性能,我们相信 Calbryte™ 520,Calbryte™590 和 Calbryte™630 钙检测试剂为各种生物系统中的细胞内钙分 析和监测提供了新的强大工具。
    正如可能预测的那样,Ca 2+分析中许多研究人员的兴趣从细胞水平转移到亚细 胞水平。 已经发现 Ca 2+在整个细胞中均匀分布,并且在多种细胞(例如,卵母细 胞,心肌细胞,肝细胞和外分泌细胞)中观察到 Ca 2+的细胞内异质性(例如 Ca 2+ waves and Ca 2+ sparks)。 随着 20 世纪 80 年代共聚焦激光扫描显微镜(CLSM) 和 2000 年代先进的酶标仪(如 FLIPR,FDSS 和 NOVOStar 专用于细胞内 Ca 2+检测) 的出现,细胞内 Ca 2+的测量显著加速。 共聚焦激光扫描显微镜和最近的多光子显 微镜除了测量其浓度外,还允许在亚细胞水平上对细胞内 Ca 2+信号传导进行精确的 空间和时间分析。

名称                                       规格              
新型钙离子荧光探针 Calbryte™ 530,AM           2x50 ug      
新型钙离子荧光探针 Calbryte™ 590,AM           2x50 ug          
新型钙离子荧光探针 Calbryte™-520LAM           10x50 ug       
新型钙离子荧光探针 Calbryte™ 630,AM           10x50 ug